L'Expérience

L'électrophorèse de l'ADN est une technique de biologie moléculaire qui permet de séparer des fragments d'ADN de différentes tailles en les faisant migrer dans un gel d'agarose en les soumettant à un courant électrique.

La situation est recréée artificiellement compte tenu de l'interdiction d'utiliser des prélèvements d'origine humaine en travaux pratiques.

Les hémoglobines sont reconstituées à partir de solutions. Ces dernières sont préparées à partir de cristaux d'hémoglobine.

L'hémoglobine des individus hétérozygotes est reconstituée en mélangeant un volume de chacune des deux solutions A et S tandis que l'hémoglobine des individus homozygotes correspond à chacune des deux solutions A et S fournies qui sont utilisées directement.

PRÉPARATION

Préparation du tampon de migration :

Introduire la totalité du sachet nommé TRIS HIPPURATE dans un flacon en verre opaque (contre les rayons du soleil) et y ajouter 1 L d'eau déminéralisée.

Réalisation des solutions d'hémoglobine à déposer :

Noter A le microtube à bouchon rouge (hémoglobine normale).

Noter S le microtube à bouchon mauve (hémoglobine anormale).

Prélever 105 µL à la micropipette de la solution contenue dans le microtube à bouchon rouge. 

Verser dans un microtube vide et propre. 

Noter ce tube "A/S"

Prélever 105 µL à la micropipette de la solution contenue dans le microtube à bouchon mauve. 

Verser dans le microtube "A/S".

Agiter ce microtube.

Préparation des bandes d'électrophorèse : 

Ouvrir le paquet de bandes d'acétate. 

Prendre les bandes avec des pinces fines et les manipuler avec précaution.

Faire tremper les bandes d'acétate de cellulose pendant 15 minutes dans le tampon de migration.

Déposer les bandes sur un papier filtre afin d'éliminer l'excès de tampon.

Placer les bandes sur le support de la cuve à électrophorèse. 

(pour savoir sur quelle face de la bande déposer les protéines il faut se repérer à l'aide de l'encoche qui sera placée du côté de l'électrode noire de la cuve) 

MANIPULATION

Réalisation des dépôts :

Dépôt n°1 :

Tremper un capillaire de dépôt dans le microtube noté "A".

Appliquer le capillaire sur la bande d'acétate déjà en place sur son support, au tiers de l'extrémité du côté de la borne noire (cathode) de façon à faire un goutte de dépôt.

Remettre le capillaire dans le microtube noté "A".

Dépôt n°2 :

Tremper un capillaire de dépôt dans le microtube noté "A/S".

Appliquer le capillaire sur la bande d'acétate déjà en place sur son support, au tiers de l'extrémité du côté de la borne noire (cathode) de façon à faire un goutte de dépôt.

Remettre le capillaire dans le microtube noté "A/S".

Dépôt n°3 :

Tremper un capillaire de dépôt dans le microtube noté "S".

Appliquer le capillaire sur la bande d'acétate déjà en place sur son support, au tiers de l'extrémité du côté de la borne noire (cathode) de façon à faire un goutte de dépôt.

Remettre le capillaire dans le microtube noté "S". 

Lancement de l'électrophorèse : 

Remplir la cuve avec le tampon de migration de manière à recouvrir les électrodes. 

Fermer la cuve et mettre sous tension (environ 60 minutes à 150V).

Coloration des bandes :

Après migration, placer les bandes dans le colorant issu de la bouteille notée "rouge ponceau" pendant 10 minutes. 

Décolorer les bandes dans trois bains successifs de 3 minutes d'acide acétique à 5%.

RÉSULTATS ET INTERPRÉTATION

On obtient le résultat suivant :

Les 2 hémoglobines A et S ne diffèrent que par un acide aminé. C'est pourquoi la différence de migration est si faible. Mais on distingue tout de même les deux hémoglobines par leur mobilité électrophorique. 

En appliquant cette technique à l'hémoglobine d'un individu on peut donc déterminer quelle(s) hémoglobine(s) il possède et en déduire son génotype : hétérozygote (HbA/HbS) ou homozygote (HbA/HbA ou HbS/HbS).